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KONSTRUKTION UND CHARAKTERISIERUNG REKOMBINANTER BISPEZIFISCHER ANTIKÖRPER-FRAGMENTE ZUR EXPERIMENTELLEN


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    Sinopse

    Diplomarbeit aus dem Jahr 2002 im Fachbereich Chemie - Biochemie, Note: 1,0, Universitat Bielefeld (Fakultat fur Chemie), Sprache: Deutsch, Abstract: Inhaltsangabe:Einleitung: Ein CD30+-Hodgkin-Lymphom ist eine maligne Erkrankung, fur die eine Antikorpertherapie sehr vielversprechend ist. ZIel der Arbeit war es, fur einen solchen Therapieansatz aus den DNA-Sequenzen herkommlicher rekombinanter bispezifischer Antikorper-Fragmente ein im Bezug auf Wirksamkeit und Stabilitat optimiertes Format herzustellen und zu charakterisieren. ZUr Optimierung der Expression sollten zwei bispezifische Diabodies anti-CD16/CD30 bakteriell exprimiert und aufgereinigt werden. DIe verbesserten Expressionseigenschaften einer Variante des bsDb gegen CD30 (mCD30) sollte durch den Vergleich mit dem Wildtyp bsDb bestatigt werden. Aus den scFv gegen CD30 und CD16 sollten anschlieSSend zwei bispezifische und tetravalente Tandemdiabodies mit unterschiedlichen Aminosaure-Linkern generiert werden. DIe Konstrukte der TandDb sollten ebenfalls exprimiert und aufgereinigt werden. DIe Antikorper-Fragmente mit der Spezifitat anti-CD30/CD16 dirigiert NK-Zellen an H-RS-Zellen, initiieren die ADCC der NK-Zellen und fuhrt zu einer spezifischen Lyse der H-RS-Zellen. EIn weiteres Ziel war es, die im Rahmen dieser Arbeit hergestellten rekombinanten Antikorper-Fragmente zu charakterisieren und im Rahmen eines in vitro-Cytotoxizitatstests gegen eine etablierte Hodgkin Zelllinie die therapeutischen Wirksamkeit zu uberprufen. AUf diese Weise sollten neuartige Formen rekombinanter Antikorper-Fragmente generiert und getestet werden, um die Grundlage fur eine effektive Antikorper-basierte Therapie fur die Hodgkinsche Krankheit zu etablieren. Inhaltsverzeichnis:Inhaltsverzeichnis: 1.EInleitung1 1.1Die Hodgkinsche Krankheit1 1.2Molekularbiologische Eigenschaften von Hodgkin-und Reed-Sternberg-Zellen3 1.3Das CD30-Antigen5 1.4Cytotoxische Mechanismen von naturlichen Killerzellen7 1.5Struktur und Funktion von Immunglobulinen und bispezifischen Antikorper-Fragmenten (Diabodies/Tandemdiabodies)9 2.AUfgabenstellung14 3.ZUsammenfassung15 4.MAterial16 4.1Laborbedarf16 4.2Gerate16 4.3Chemikalien17 4.4Puffer, Medien und andere Losungen18 4.5Enzyme21 4.6Antikorper21 4.7Bakterienstamme22 4.8Zelllinien22 4.9Oligonucleotide23 4.10Vektoren24 5.MEthoden26 5.1Molekularbiologische Methoden26 5.1.1Polymerase-Kettenreaktion (PCR)26 5.1.2Splice overlap extension-PCR26 5.1.3Restriktionsspaltung von DNA27 5.1.4Agaroseelektrophorese von DNA-Fragmenten27 5.1.5Dephosphorylierung von 5 -Enden der linearisierten Vektoren28 5.1.6Ligation von DNA-Fragmenten28 5.1.7Transformation von kompetenten Bakterien28 5.1.8Isolierung von Plasmid-DNA aus E. COli29 5.1.9Konservierung der Bakterienklone29 5.2Proteinbiochemische Methoden29 5.2.1Praparation von periplasmatischen Extrakten29 5.2.2GroSSexpression von Antikorper-Fragmenten in E. COli30 5.2.3Isolierung von Antikorper-Fragmenten aus dem periplasmatischen Raum30 5.2.4Dialysemembranen31 5.2.5Ammoniumsulfatprazipitation der Antikorper-Fragmente31 5.2.6Immobilisierte Metall-Chelat-Chomatographie (IMAC)31 5.2.7SDS-PAGE32 5.2.8Westernblot-Analyse32 5.2.9uberprufung des Klonierungserfolgs33 5.2.10Ionenaustauschchromatographie33 5.2.11Bestimmung der Protein-Konzentration34 5.2.12Bestimmung des Antikorper-Formats35 5.3Zellkultur-Methoden35 5.3.1Kultivierung eukaryontischer Zellen35 5.3.2PBMC-/Granulozyten-Praparation36 5.3.3BsAk-vermittelter in vitro-Cytotoxizitatstest37 5.4Durchflusscytometrie38 5.4.1Bindungstest von periplasmatischen Extrakten und aufgereinigten Antikorper-Fragmenten39 5.4.2Titrati...

    Detalhes do Produto

      • Origem:  IMPORTADO
      • Editora: GRIN VERLAG
      • Edição:  1
      • Ano:  2002
      • Idioma: INGLÊS
      • País de Produção: Germany
      • Código de Barras:  9783838660042
      • ISBN:  3838660048
      • Encadernação:  BROCHURA
      • Altura: 210.00 cm
      • Largura: 148.00 cm
      • Comprimento: 7.00 cm
      • Peso: 0.17 kg
      • Nº de Páginas:  108

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